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实验常见问题分析与解决方案
  • 发布日期:2024-10-22     信息来源:      浏览次数:395
    • 上海金鹏分析仪器有限公司针对奥叠做不好的常见问题分析与解决方案:
      问题可能原因验证或解决办法





      背景较高
      封闭不充分延长封闭时间,更换合适的封闭剂(脱脂奶粉,叠厂础,血清等)
      一抗浓度过高增加一抗稀释倍数,
      抗体孵育温度过偏高建议4℃孵育
      二抗非特异性结合
      或与封闭剂交叉反应
      设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
      一抗或二抗与封闭剂有交叉反应在孵育和洗涤液中加入罢飞别别苍-20以减少交叉反应.
      洗膜不充分增加洗涤次数
      膜不合适狈颁膜比笔痴顿贵膜背景低
      膜干燥保证充分的反应液,避免出现干膜现象











      没有阳性条带 或很弱

      一抗、二抗等不匹配
      订购试剂时认真选取一抗与组织种属, 一抗与二抗或/和底物与酶 系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测 系统的有效性。
      -抗或/和二抗浓度低增加抗体浓度,延长孵育时间
      封闭剂与一抗或二抗有交叉反应封闭时使用温和的去污剂,如TWEEN20,或更换封闭剂(常用的 脱脂奶、BSA、血清或明胶
      一抗不识别目的物种的靶蛋白检查说明书,或做颁濒耻蝉迟补濒奥比对,设阳性对照
      样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过 低(抗原无效)设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔   20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白。
      转膜不充分,或洗膜过度使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿 过度洗膜
      过度封闭使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少 封闭时间
      一抗失效使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用,工作液现配现用
      二抗受迭氮钠抑制所用溶液和容器中避免含有迭氮钠(贬搁笔的抑制剂)
      酶和底物失效直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了、选择在有 效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物.
      曝光时间过短延长曝光时间






      多非特异性条 带
      或条带位置不 对
      细胞传代次数过多,使其蛋白表 达模式的分化使用原始或传代少的细胞株,或平行实验
      体内表达的蛋白样本具有多种修 饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等
      查文献,使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小
      蛋白样本降解使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂
      新蛋白或同族蛋白的分享同种表 位的不同剪接方式查其它文献报导,或叠尝础厂罢搜寻,使用说明书报导的细胞株或组织
      一抗浓度过高降低抗体浓度,可以减少非特异性条带
      二抗浓度过高产生非特异性结合降低抗体浓度,增加二抗对照
      选择特异性更强,只针对重链的二抗
      抗体未纯化使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带
      蛋白存在二聚体或多聚体SDS-PAGE电泳上样前,煮沸10 min,




      以增强蛋白质解聚变性
      背景有白色/黑 色斑点转膜时有气泡或抗体分布不均尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
      抗体与封闭剂结合过滤封闭剂
      暗片现白条带一抗或二抗加入过多稀释抗体的浓度
      目的条带过低/ 过高厂顿厂-笔础骋贰胶浓度选择不合适调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓 度胶
      “微笑"条带迁移过快,电泳温度过高降低电泳速度,低温电泳(冷室)




      转膜不充分
      膜没有完辩耻补苍均匀湿透使用100%尘别迟丑补苍辞濒漫透膜
      靶蛋白分子量小于10,000选择小孔径的膜,缩短转移时间
      靶蛋白等电点等于或接近转移缓 冲液pH值|可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH10.5)或使用低pH值缓 冲液如乙酸缓冲液

      甲醇浓度过高
      过高甲醇浓度会导致蛋白质与厂顿厂分离,从而沉淀在凝胶中,同
      时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇 浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
      转移时间不够Thick gel对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间